Vysoká škola chemicko – technologická v Praze

Stanovení akutní a semichronické toxicity neznámých látek, např. výluhů z průmyslových odpadů nebo ze skládek, odpadních vod určených pro zavlažování, slouží k určení toxického vlivu látek na vodní organismy a semena rostlin. Zatímco testy chronické toxicity se používají k určení negativních účinků látek při jejich dlouhodobém působení na organismy, slouží akutní testy toxicity k určení okamžitého účinku látek, který vyvolává úhyn organismů, v mírnějším případě jejich stresové chování. Výsledkem ekotoxikologické zkoušky je hodnota efektivní koncentrace testované látky EC50, při které dochází k úhynu nebo imobilizaci 50% organismů. Hodnota EC50 bývá udávána v jednotkách mg/l nebo ml/l. Podle této hodnoty lze testovanou látku zařadit do tříd toxicity a odhadnout míru jejího škodlivého působení na vodní organismy.

1.2 Princip testu :

Postup ekotoxikologického hodnocení látek je schematicky znázorněn na obrázku č.1.

Obrázek č.1. Schéma postupu při testu toxicity.

1.3 Předběžný test

V předběžném testu se vzorek o neznámé toxicitě podrobí první zkoušce s testovacími organismy. Jde o to, zjistit, zda látka vykazuje toxické účinky či nikoliv. Používají se dvě paralelní nasazení se dvěma kontrolami. Nedojde-li k úhynu žádného organismu, je předběžný test hodnocen jako negativní a přistoupí se k ověřovacímu testu.

1.4 Ověřovací test

Negativní výsledek předběžného testu se ověřuje v šesti paralelních nasazeních. Nedojde-li v testovaných roztocích k úhynu o 10% převyšující úhyn v kontrole, je i zde výsledek hodnocen jako negativní. Další testování se neprovádí. Je-li výsledek pozitivní, úhyn v testovaném vzorku převýší o více než 10% úhyn v kontrole, záleží další postup na míře imobilizace či úhynu. V případě mortality nižší 50% se další testy neprovádejí a zjištěné skutečnosti se zaznamenají do protokolu. Překročí-li mortalita 50%, přistupuje se k orientačnímu testu.

1.5 Orientační test

Účelem tohoto testu je určení rozmezí, ve kterém lze očekávat hodnotu EC50 testované látky. Používá se zde zpravidla 10 koncentrací vodného výluhu, volených v širokém rozpětí. Do tohoto testu se nasazuje menší počet pokusných organismů, obvykle postačuje testovat jednu koncentrační řadu a do každé testované koncentrace nasadit 4 organismy. Cílem je zjistit nejvyšší koncentraci látky, při které ještě nedochází k úhynu či imobilizaci organismů (OC0) a nejnižší koncentraci, která již působí letálně (OC100).

1.6 Základní test

Základní test slouží k vlastnímu určení hodnoty EC50. Test sestává zpravidla ze 7mi různých koncentrací vodného výluhu v rozmezí stanoveném orientačním testem. Ředění se provádí tak, aby kolem předpokládané hodnoty EC50 došlo k úhynu nebo imobilizaci 5 - 95 % organismů ve třech či více ředěních. Jako nejvyšší a nejnižší koncentrace ředící řady se volí limitní koncentrace zjištěné orientačním testem. Pro každou koncentraci se nasazují 2 - 3 paralelní nasazení. Po 24 a 48,72 hodinách se odečítá počet uhynulých či imobilizovaných organismů. Ze zjištěných údajů se spočítá hodnota EC50. Na začátku i konci pokusu se zaznamenává teplota, koncentrace rozpuštěného kyslíku a pH v každé testované koncentraci.

1.7 Interpretace výsledků

Výsledek ekotoxikologických testů je negativní, jestliže v ověřovacím testu nedojde k překročení 10% imobilizace či úhynu ve srovnání s kontrolou.

Jestliže v ověřovacím testu uhyne méně než 50% (ale více než 10%) testovaných organismů nelze hodnotu EC50 stanovit a tato skutečnost se uvede do protokolu. Výsledek je hodnocen jako pozitivní.

Způsobuje-li testovaná látka větší než 50ti% úhyn nebo imobilizaci, je výsledkem ekotoxikologické zkoušky hodnota EC50, popř. i doplňkové hodnoty EC10, EC90, EC50/NOEC.

2 Pracovní roztoky pro ekotoxikologické testy

2.1 Úprava vzorku

Do odměrné baňky potřebného objemu se odměří část vzorku. Poté se nadávkují zásobní roztoky solí, jejichž objem závisí na potřebném objemu vzorku. Na 1 litr vzorku se dávkuje 2,5 ml zásobních roztoků solí. Objem baňky se doplní po rysku vzorkem. Je-li testovaná látka pevného skupenství, pořídí se nejprve její zásobní roztok o známé koncentraci. Dále se postupuje jako se vzorky ve stavu kapalném. Popřípadě je možné rozpustit látku přímo ve zřeďovací vodě.

2.2 Příprava zřeďovací vody, živného média :

Do zásobní nádoby se odměří větší část redestilované vody, pak se do ní nadávkují zásobní roztoky solí (viz. níže). Dávkuje se vždy 2,5 ml zásobního roztoku každé soli na 1 litr média. Po nadávkování solí se zásobní nádoba doplní destilovanou vodou až po požadovaný objem. Je-li k dispozici voda deionizovaná, je lépe dávkovat větší množství solí. Osvědčilo se množství zdvojnásobit na 5 ml.

Hodnota pH zřeďovací vody by se měla pohybovat v rozmezí 7,6 - 8,0. Případná úprava pH se provádí 1M roztokem NaOH, popř. HCl. Dostatečné množství rozpuštěného kyslíku je třeba zajistit aerací. Voda musí být kyslíkem nasycená minimálně z 90%. Je vhodné připravit zřeďovací vodu alespoň den před jejím použitím a aerací přes noc zabezpečit nejen nasycení kyslíkem, ale i dokonalé rozpuštění solí a homogenizaci média.

2.3 Zásobní roztoky solí pro zřeďovací vodu:

· Zásobní roztok č. 1 : 117,6 g CaCl₂ . 2H₂O (p.a.) se rozpustí a doplní do 1 litru destilovanou vodou.

· Zásobní roztok č. 2 : 49,3 g MgSO₄ . 7 H₂O (p.a.) se rozpustí a doplní do 1 litru destilovanou vodou.

· Zásobní roztok č. 3 : 25,9 g NaHCO₃ se rozpustí a doplní do 1 litru destilovanou vodou.

· Zásobní roztok č. 4 : 2,3 g KCl (p.a.) se rozpustí a doplní do 1 litru destilovanou vodou.

2.4 Příprava kultivačního média, Knoppova roztoku pro řasy

Do zásobní nádoby se odměří větší část destilované vody, pak se do ní nadávkují zásobní roztoky solí. Dávkuje se vždy 10 ml solí č.1-3 a 1 ml soli č.4 na 1 litr média. Po nadávkování solí se zásobní nádoba doplní destilovanou vodou až po požadovaný objem.

2.5 Zásobní roztoky solí pro kultivaci řas,

Kultivační médium pro chov řas dle ISO.

koncentrace, mg.l^-1

1 litr 2 l 3 l 4 l 5 l

NaNO₃ 467 934 1401 1868 2335

Ca(NO₃)₂ . 4H₂O 59 118 177 236 295

K₂HPO₄ 31 62 93 124 155

MgSO₄ . 7H₂O 25 50 75 100 125

Na₂CO₃ 21 42 63 84 105

Zásobní roztok koncentrace, ml.l^-1

Fe-EDTA 10 20 30 40 50

Gaffronův roztok 0,08 0,16 0,24 0,32 0,4

Roztok stopových prvků podle Gaffrona.

koncentrace, mg.l-1

H₃BO₃ 3100

MnSO₄ . 4H₂O 2230

Na₂VO₄ . 2H₂O 33

(NH₄)6Mo₇O₂₄ . 4H₂O 88

KBr 119

KI 83

ZnSO₄ . 7H₂O 287

Cd(NO₃)₂ .4H₂O 154

Co(NO₃). H2O 146

CuSO₄ . 5H₂O 125

NiSO₄(NH₄)₂SO₄ . 6H₂O 198

Cr(NO₃)₃ . 7H₂O 37

V₂O₄(SO₄)₃ . 16H₂O 35

Al₂(SO₄)₃K₂SO₄ . 24H₂O 474

2.5.1 Knoppův roztok:

Knopův roztok se používal dříve jako medium pro chov řas. Jeho výhodou je jednodušší příprava.

· Zásobní roztok č. 1 : 100 g KNO₃ (p.a.) se rozpustí a doplní do 1 litru destilovanou vodou.

· Zásobní roztok č. 2 : 10 g K ₂HPO₄ (p.a.) se rozpustí a doplní do 1 litru destilovanou vodou.

· Zásobní roztok č. 3 : 10 g MgSO₄ . 7 H₂O (p.a.) se rozpustí a doplní do 1 litru destilovanou vodou.

· Zásobní roztok č. 4 : 0,1 g FeCl₃ (p.a.) se rozpustí a doplní do 100 ml destilovanou vodou.

2.6 Laboratorní mořská voda pro testy na heterotrofních organizmech:

Mezi mořské organizmy používané pro testy toxicity patří například vířník obrněnka Brachionus plicatilis či žábronožka Artemia salina. Receptur na přípravu umělé mořské vody je celá řada. Uveďme si zde při ilustraci následující postup:

Do redestilované vody se nadávkují soli v množstvích uvedených v tabulce č.1. Pak se pH vody upraví na hodnotu 7,8. Nerozpuštěné částice se odfiltrují na filtru o velikosti pórů 0,45mm. Sterilizace vody se provede v autoklávu, kde dochází ke zvýšení pH na 8±0,1. Připravená voda by měla být uchovávána maximálně 5 dní a to ve tmě a při teplotě 4-5°C .

Tab.č.1 Složení laboratorní mořské vody.

Vzorec soli	koncentrace, g.l^-1
NaCl	23,96
MgSO₄.7H₂O	10,346
MgCl₂.6H₂O	6,5
NaBr	1,029
KCl	0,596
CaCl₂.2H₂O	0,397
SrCl₂.6H₂O	0,027
H₃BO₃	0,006
NaF	0,0042

3 Pracovní postup :

Pro potřeby laboratoří bude z důvodu úspory času a prostředků prováděn pouze základní test. Orientační test bude již dopředu proveden a studentům bude ke každému modelovému vzorku doporučen i interval, ve kterém se nachází hledaná hodnota EC50. Nejvyšší koncentrace vzorku z orientačního testu, která ještě nepůsobí na organismy toxicky, se bude označovat jako „orientační koncentrace 0“ (OC0); nejnižší koncentrace, při které došlo k úplnému úhynu testovacích organismů jako „orientační koncentrace 100“ (OC100).

3.1 Určení testovaných koncentrací

Interval sedmi koncentrací v rozmezí OC0 až OC100 je třeba rozdělit tak, abychom v ideálním případě po provedení testu obdrželi 5 hodnot tzv. parciálních mortalit, tzn. úhynů větších než 0% a menších než 100%. Jedna koncentrace by se měla co nejvíce blížit EC50, dvě by měly být mezi hodnotou OC0 a EC50, dvě mezi EC50 a OC100 a dvě koncentrace budou odpovídat hodnotám OC0 a OC100. Rozvržení koncentrací by mělo být okolo hodnoty EC50 symetrické. Na obrázku č.2 je znázorněn princip volby testovacích koncentrací.

Obrázek č.2. Způsob volby testovaných koncentrací v intervalu OC0 až OC100.

Koncentrační řada by měla být logaritmická, následující koncentrace by měla být vždy k krát větší nežli předchozí. Koeficient k se vypočítá z následujícího vztahu, kde n představuje počet volených koncentrací, obvykle 7 :

Určené koncentrace testovaného vzorku se připraví v odměrných baňkách a přelijí do kádinek ve kterých bude testování prováděno. Pro každou koncentraci se nasazují dvě paralelky a jedna manipulační kádinka se stejnou koncentrací vzorku, množství vzorku v manipulační kádince může být menší. Každá koncentrační řada musí mít svoji vlastní kontrolu, kádinku pouze s ředící vodou.

Jsou-li připraveny koncentrační řady, změří se v každé kádince pH, koncentrace rozpuštěného kyslíku a teplota. Pak se přistoupí k dávkování mikroorganismů.

Po 24 nebo 48 hodinách se přistoupí k odečtení úhynu. V každé kádince se spočte počet uhynulých či imobilizovaných organismů. Ze získaných dat úhynu, mortality se spočítá hodnota EC50.

4 Vyhodnocení :

4.1 Princip určení EC50

Obrázek č.3. Lineární regrese závislosti úhynu na logaritmu koncentrace

Možností, jak určit ze získaných dat o úhynu organismů hodnotu EC50 je více. Každá má určité přednosti i nedostatky. Na obrázku č.2 je patrné, že závislost mortality na koncentraci má sigmoidální charakter. Takovou závislost však nelze popsat přesnou rovnicí (pomineme-li polynomy vyšších stupňů). Je třeba získaná data určitým způsobem transformovat. Nejjednodušší je postavit proti hodnotám mortality logaritmy koncentrací a závislost vyjádřit pomocí lineární regrese. V bodě EC50 má totiž křivka inflexní bod a v jejím okolí je její průběh přibližně lineární. Viz. obrázek č.3.

4.2 Probitová anlýza

Obrázek č.4. Lineární regrese závislosti probitů na logaritmu koncentrace.

Nevýhodou výše uvedeného způsobu výpočtu je, že přímka nekopíruje dostatečně úmrtnostní křivku. Při koncentracích nižších EC50 je nad křivkou a v koncentracích vyšších je pod ní. Tuto systematickou odchylku se snaží napravit probitová analýza, která vhodným způsobem transformuje úmrtnostní data na tzv. probity, které již mají na logaritmu koncentrace přibližně lineární závislost. Na obrázku č.4 je znázorněna regrese stejných dat jako na obr.3 avšak převedených na probity. Na první pohled je patrná větší linearita závislosti probitů na logaritmu koncentrace.

Převod úmrtnostních dat vyjádřených v procentech lze na probity převést podle následující tabulky. Vhodnější však je použít výpočetní program upravený pro PC.

Tabulka. Převedení úmrtnostních dat v procentech na probity

%	probit	%	probit	%	probit	%	probit	%	probit	%	probit
0,2	2,122	10,0	3,718	30,0	4,476	50,0	5,000	70,0	5,524	90,0	6,282
0,4	2,348	11,0	3,773	31,0	4,504	51,0	5,025	71,0	5,553	91,0	6.341
0,6	2,488	12,0	3,825	32,0	4,532	52,0	5,050	72,0	5,583	92,0	6.405
0,8	2,591	13,0	3,874	33,0	4,560	53,0	5,075	73,0	5,613	93,0	6,476
1,0	2,574	14,0	3,920	34,0	4,588	54,0	5,100	74,0	5,643	94,0	6,5S5
1,2	2,743	15,0	3,964	35,0	4,615	55,0	5,126	75,0	5,674	95,0	6.645
1,4	2,803	16,0	4,006	36,0	4,642	56,0	5,151	76,0	5,706	95,5	6,695
1,6	2,856	17,0	4,046	37,0	4,668	57,0	5,176	77,0	5.739	96,0	6,751
1,8	2,903	18,0	4,085	38,0	4,695	58,0	5,202	78,0	5,772	96,5	6,812
2,0	2,946	19,0	4,122	39,0	4,722	59,0	5,228	79,0	5.806	97,0	6.881
2,5	3,040	20,0	4,158	40,0	4,747	60,0	5,253	80,0	5,842	97.5	6.966
3,0	3,123	21,0	4,194	41,0	4;772	61,0	5,278	81,0	5,878	98,0	7.054
3,S	3,188	22,0	4,228	42,0	4,798	62,0	5,305	82,0	5,915	98,2	7,096
4,0	3,249	23,0	4,261	43,0	4,824	63,0	5,332	83,0	5,954	98,4	7.144
4,5	3,305	24,0	4,294	44,0	4,849	64,0	5,358	84,0	5,994	98.6	7,197
5,0	3,355	25,0	4,326	45,0	4,874	65,0	5,385	85;0	6.036	98.8	7.257
6,0	3,445	26,0	4,357	46,0	4,900	66,0	5,412	86,0	6,080	99,0	7,326
7,0	3,524	27,0	4,387	47,0	4,925	67,0	5,440	87,0	6.126	99,2	7.409
8,0	3,595	28,0	4,417	48,0	4,950	68,0	5,468	88,0	6.175	99,4	7,512
9,0	3,659	29,0	4,447	49,0	4,975	69,0	5,496	89,0	6,227	99,6	7.652
										99,8	7.878