Prezentace výsledků ekotoxikologických dat

Vladimír Kočí

Ústav chemie ochrany prostředí, VŠCHT Praha

(Pozn.: Tato práce byla publikována na jaře roku 2000. Dnes bych některé pasáže formuloval jinak. V blízké době se k této problematice ještě vrátím. Mezi nejproblematičtější pasáže považuji: Komplikovanost určení hodnot NOEC a LOEC, dose-response křivka nemusí mít sigmoidální průběh.)

Cílem tohoto sdělení je upozornit na to, že forma publikace ekotoxikologických dat je pro praxi i výzkum velice důležitá. I sebelépe provedený pokus se stává bezcenným, je-li neadekvátním způsobem statisticky vyhodnocen. Nedílnou součástí výzkumu jakéhokoliv druhu je i prezentace dosažených výsledků. Zejména u takových prací, kde je možné experimentální data ošetřovat několika více či méně odlišnými statistickými přístupy, je volba metody a její zdůvodnění velmi důležité. K tomu, aby bylo možné výsledky biologických pokusů odpovídajícím způsobem publikovat a porovnávat mezi sebou, je třeba shodnout se nejen na podmínkách jejich provádění, ale i vyhodnocování. Shrňme si, co je cílem při prezentování ekotoxikologických dat. Jde o to, vhodným způsobem popsat toxické účinky testované látky na organizmy, uvést, jak se toxické účinky mění s koncentrací, nabídnout takové údaje, aby bylo možné toxickou látku srovnat s jinými látkami a uvést spolehlivost zveřejněných hodnot.

EC50

Popis toxických účinků v závislosti na koncentraci je klíčovou otázkou v ekotoxikologii. Z hlediska životního prostředí jsou důležité ty koncentrace, které se mohou reálně vyskytovat, a které působí na organizmy dlouhodobě. Jedná se o koncentrace relativně nízké, jejichž laboratorní testování je velmi komplikované. Se současným přístupem k experimentu také nemožné. V těchto nízkých koncentracích (odpovídajících např. EC 0,1 a méně) jsou intervaly spolehlivosti příliš široké. Lepší je používání NOEC, nevýhodou při jejím určení je to, že nemáme zaručeno, zda jsme v testu nepoužily jedince odolnější než je průměr (o této problematice se zmiňuje Marvan[1]). Zatím tedy není znám lepší přístup k exaktnímu hodnocení toxických účinků než určovat EC50. V tomto bodě má křivka závislosti ekotoxikologické odezvy na koncentraci testované látky inflexní bod a lze jej relativně přesně stanovit.

Experimentální určení hodnoty EC50 je vždy zatíženo chybou, o to důsledněji je třeba uvádět intervaly spolehlivosti. Bez intervalů (obvykle na hladině významnosti 95%) není možné si udělat představu o výpovědní hodnotě zjištěné EC50. Stejně důležité při publikování výsledků je uvádět jakým způsobem byla EC50 vypočtena a jaký aproximativní model se pro experimentální data hodí. To ovlivňuje nejen samotnou hodnotu EC50, ale i již zmíněné intervaly spolehlivosti. Při výběru regresní funkce je třeba vzít do úvahy nejen to, zda aproximativní funkce dobře prokládá naměřené hodnoty, ale zda také odpovídá reálným podmínkám závislosti účinku na koncentraci. Ne vždy musí úzký interval spolehlivosti EC50 dokazovat, že zvolený aproximativní model je vhodný pro hodnocení ekotoxikologického experimentu. Cílem volby regresní funkce by nemělo být získat co nejužší intervaly spolehlivosti, ale „správné“ intervaly spolehlivosti. Otevřenou otázkou zůstává, jak takové intervaly získat. V praxi často používaný postup použití polynomů vyšších stupňů nejenže nemusí odpovídat reálné závislosti účinku na koncentraci, ale rovněž poskytuje příliš úzké intervaly spolehlivosti. Zde jsme u jádra problému jak hodnotit správnost vypočtené EC50. Úzký interval spolehlivosti říká, že aproximativní model dobře „sedí“ na experimentální hodnoty, nemusí však nic vypovídat o chybě experimentálních dat. Jsou-li k výsledným EC50 pokusů uváděny intervaly spolehlivosti bez bližší specifikace jejich určení, není opět možné vytvořit si představu o tom, jak vypočtená EC50 odpovídá reálným podmínkám. Celá tato otázka se týká případu, kdy je EC50 určována ze závislosti účinku na koncentraci metodami jako je např. probitová, a ne z několika již vypočtených EC50.

Užití poměrů EC50/NOEC a EC50/LOEC

Důležitým faktorem při posuzování toxických účinků látek je vedle EC50 i strmost křivky závislosti účinku na koncentraci. Dvě různé látky mající stejné EC50 nemusí být z hlediska ekotoxikologie stejně závažné, neboť jedna z nich může při nižších koncentracích být již neškodná, zatímco druhá může stále způsobovat úhyn značného množství organizmů. Používání směrnice regresního modelu účinek-(log)koncentrace není vždy vhodné a ani se zatím neujalo. Vhodnějším parametrem se jeví poměr EC50/NOEC.[2] Stejně může sloužit i parametr EC50/LOEC.

Pro demonstraci praktického užití parametru EC50/NOEC, resp. EC50/LOEC jsou zde použity výsledky z ekotoxikologického výzkumu pracích prostředků. Byly testovány páry stejných prášků, kde jediným rozdílem bylo složení aktivační přísady. Jeden prací prostředek byl vždy fosforečnanový a druhý zeolitický. Detergenty jednoho páru budou označeny stejným komerčním názvem a rozlišeny písmeny P a Z. Cílem výzkumu detergentů bylo rozhodnout, který prací prostředek páru je toxičtější. Prací prostředky byly testovány v původní a pozměněné formě po procesu praní na různých testovacích organizmech (D. magna, P. reticulata, Ch. kessleri, Br. plicatilis, S. alba, P. phosphoreum). Dalšími srovnávanými dvojicemi vzorků byly 3 druhy zeolitu A. Celkem bylo provedeno porovnání 51 párů vzorků. U 40 párů vzorků bylo možné provést srovnání toxických účinků obou látek pomocí EC50 i EC50/NOEC či EC50/LOEC.

U 12 párů nebyly hodnoty EC50 statisticky významně odlišné, pomocí poměru EC50/NOEC či EC50/LOEC však bylo možné rozhodnout, která z látek je toxičtější. Poměry EC50/NOEC a EC50/LOEC jsou pro tento účel stejně vhodné, ačkoli jsou rozdíly mezi EC50/LOEC látek v páru menší. Příkladem je test pracího prostředku Lanza po procesu praní na organizmu Daphnia magna. Vzhledem k širokému intervalu spolehlivosti v případě fosforečnanové modifikace není možné statisticky významně rozlišit hodnoty EC50 pro obě látky: 40,6 mg.l^-1 (36,2; 45,0) pro zeolitický a 47,3 mg.l^-1 (23,9; 70,6) pro fosforečnanový. Bez přihlédnutí k intervalům spolehlivosti bychom mohli učinit nesprávný závěr, že zeolitická Lanza je toxičtější (EC50 je nižší). Bereme-li v úvahu intervaly spolehlivosti, musíme konstatovat, že mezi hodnotami EC50 není statisticky významný rozdíl. S přihlédnutím k poměru EC50/NOEC (EC50/LOEC) však můžeme získaná experimentální data interpretovat přesněji: Hodnoty EC50 Lanzy Z a Lanzy P se statisticky významně neliší, z ekotoxikologického hlediska je však přijatelnější Lanza Z, protože její poměr EC50/NOEC=2,0 (EC50/LOEC =1,6) je nižší než odpovídající poměr Lanzy P, EC50/NOEC=4,7 (EC50/LOEC =3,2).

Obr. 1 Lanza Z a Lanza P po procesu praní, D. magna

U 6 párů detergentů byly rozdíly hodnot EC50 statisticky významné. Bylo tedy možné na základě této informace rozhodnout o větší toxicitě jedné z látek, avšak s přihlédnutím k EC50/NOEC či EC50/LOEC byly látky v páru hodnoceny jako srovnatelně toxické. Jednalo se o případy, kdy si byly hranice intervalů spolehlivosti hodnot EC50 blízké, a kdy poměr EC50/NOEC či EC50/LOEC látky s vyšší hodnotou EC50 byl výrazně vyšší než odpovídající poměr druhé látky v páru. Tento případ ilustruje test Colonu před procesem praní na Daphnia magna. Hodnota EC50 zeolitické formy detergentu je sice statisticky významně nižší, EC50_{Colon Z}(22,3; 30,5) a EC50_{Colon P}(31,7; 43,5), ale s přihlédnutím k poměrům EC50/NOEC a EC50/LOEC, kdy Colon Z vykazuje EC50/NOEC=5,3 a EC50/LOEC=3,3 a Colon P EC50/NOEC=7,5 a EC50/LOEC=4,7, je třeba hodnotit toxické účinky těchto látek za srovnatelné.

Obr. 2 Colon P a Colon Z před praním, D. magna

Ve výše uvedeném výzkumu pracích prostředků byly pro hodnocení rozdílu v toxickém působení 40 párů látek v 18 případech kromě hodnoty EC50 určující i poměry EC50/NOEC nebo EC50/LOEC. To je dostatečně velké procento k tomu, aby bylo možno doporučit poměr EC50/NOEC nebo EC50/LOEC jako vhodný doplněk hodnoty EC50.

TU

Snaha zjednodušit hodnocení toxických účinků látek zavedením nových parametrů nemusí být vždy na místě. Příkladem je nově zavedený parametr - jednotka toxicity TU (Toxicity Unit)[3]^,[4] doporučovaný i U.S. EPA.

TU = 100(mg.l^-1)/EC50(mg.l^-1)

Na první pohled by se mohlo zdát užití tohoto parametru praktické. Není tomu tak. V širokém používání takového parametru lze spatřovat určitý úbytek snahy prezentovat výsledky experimentů s co největší vypovídající hodnotou. TU se přesto začíná používat i v praxi. V příručce k testu Microtox [5] (str. 420) se TU doporučuje jako parametr, který svým vyšším číslem indikuje vyšší toxické účinky látky ve srovnání s EC50, kde nižší koncentrace značí vyšší toxicitu. To je zde považováno za klad, zejména kvůli přehlednosti pro pracovníky v praxi. Tento argument nelze považovat za adekvátní. Každý, kdo pracuje s ekotoxikologickými daty by měl být schopen vnímat nepřímou závislost míry toxicity a hodnoty EC50. Dále je TU doporučována jako prostředek ke srovnání toxických účinků dvou látek. V uvedeném příkladě návodu pro Microtox je konstatováno, že vzorek s TU 20 je dvakrát toxičtější než druhý s TU 10. To ovšem nelze na základě TU tvrdit. TU je vypočtená z EC50 a sama o sobě další informaci neposkytuje. Nelze tedy z parametru vypočteného z EC50 vyvozovat závěry o relativní toxicitě látek, k čemu např. ve zmíněné příručce došlo.

Chceme-li srovnat dvě toxické látky a konstatovat, že jedna z nich je x krát toxičtější, nemůžeme toto srovnání provést na základě hodnot EC50 a potažmo ani TU. K tomu je nutné provést test rovnoběžnosti křivek závislosti ekotoxikologické odezvy na koncentraci. V případě, že je předpoklad rovnoběžnosti splněn, lze vypočíst odhad relativní toxicity včetně jeho intervalů spolehlivosti. [6]Tento postup je k dispozici již mnoho let v oblasti klinické toxikologie a pro zájemce je dobře dostupný.

Shrnutí

Ke každému výzkumu neoddělitelně patří i odpovídající prezentace získaných údajů. Pro kvalitní publikaci naměřených ekotoxikologických dat je zde doporučováno uvádět vedle EC50 a intervalů spolehlivosti i metodu jejího výpočtu a parametr EC50/NOEC, případně EC50/LOEC. Oba parametry se osvědčily jako vhodná doplňková hodnota EC50 pro porovnávání toxických účinků různých vzorků. Je zde kriticky diskutováno používání toxické jednotky TU a upozorněno na skutečnost, že nelze z EC50 a hodnot z ní odvozených činit závěry při srovnávání účinků látek v pojmech relativní toxicity.